基于固態(tài)激光器的簡單易用的單箱相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）顯微鏡，省去了兩臺要求高度同步的摻鈦藍寶石激光器。 Heinz P. Huber，Sandra Zoppel，Ingo Rimke 在過去的十年間，基于非線性光學效應的多光子顯微技術在提高顯微成像對比度和分辨率方面日益得到重視。通過增加照明光源的強度，這些非線性效應提高了圖像的橫向和縱向分辨率，實現(xiàn)了微尺度范圍內的三維成像。在諸多多光子成像技術中，雙光子激發(fā)熒光顯微鏡被廣為采用，每年至少要安裝幾百套基于該技術的系統(tǒng)。[1]雙光子成像使用同時吸收兩個光子的辦法來激發(fā)一個染料分子，其目的是獲得跟激發(fā)波長相比具有藍移的熒光。 可調諧飛秒激光被用作雙光子激發(fā)的光源。通過共焦顯微鏡，熒光信號可以很容易地從激發(fā)背景中探測到，在現(xiàn)代生命科學中利用特定的染料分子，幾乎可以看到所有的生理過程。 然而，雙光子熒光顯微鏡的最大缺點是使用染料來成像，因為它們的毒性會改變機體內的生理過程。熒光蛋白質（如綠熒光蛋白）經常被用來代替染料，但是這種方法涉及復雜的基因樣本復制技術。此外，這些染料在數(shù)分鐘內被漂白的特性，將使熒光信號逐漸減弱。 基于非線性光學效應的一些方法被用于克服與染料相關的問題，這些效應包括二次或三次諧波產生（SHG或THG）、拉曼散射，或是相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）。CARS是一個涉及四個光子的三階非線性效應（X(3)過程）。 在CARS過程中，頻率為ωp的泵浦光和頻率為ωs的斯托克斯光把樣品激發(fā)到一個虛態(tài)（virtual state），并產生頻率為ωp-ωs的分子振動。如果ωp-ωs等于分子的特征拉曼頻率Ω，這種振動激發(fā)就會非常有效。通過三階非線性過程產生的頻率為ωas = (ωp-ωs) + ωp的反斯托克斯邊帶是最終的測量信號（見圖1）。通過主動驅動振蕩和相干作用，CARS信號會遠遠高于普通的拉曼散射。 圖1：在CARS方案中，泵浦脈沖（ωp）和斯托克斯脈沖（ωs）產生了信號頻率（ωas）。使用CARS進行成像可以獲得相同的對比度而不需要使用染料，產生較強的頻率為ωas的藍移信號，可以很容易地從激發(fā)背景中區(qū)分和探測（見圖2）。CARS信號對樣品的振動模敏感，可以對活體內的分子振動密度成像。 圖2：CARS顯微鏡捕獲的線蟲（上圖）和活酵母細胞（下圖）展示了高對比度和較高的圖像質量，這也證明了這種技術的可行性。在線蟲圖像里，可以清楚地看到腸道和受精卵。腸道中血脂在2845cm-1產生很強的CARS信號（積分時間為5s）。活酵母細胞在2845cm-1共振處被記錄（積分時間是1s）。兩幅圖的尺寸都是150×150